質(zhì)粒DNA純化的實(shí)驗(yàn)方法！

時間：2020-05-19作者：北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司瀏覽：111

質(zhì)粒DNA純化的實(shí)驗(yàn)方法！

中國微生物菌種查詢網(wǎng)：通常，大量提取的質(zhì)粒DNA一般都需進(jìn)一步純化，常用的方法有柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。那么，質(zhì)粒DNA純化的實(shí)驗(yàn)方法主要有哪些呢？

一、連續(xù)梯度的實(shí)驗(yàn)方法
⒈測量DNA溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl, 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
⒉每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應(yīng)為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml。溴化乙錠貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)（如用錫箔完全包裹的瓶子），于室溫保存。
⒊室溫下用Sorvall SS34頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以8000rpm離心5min， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。
⒋用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。
⒌以20℃對所得的密度梯度以45 000rpm離心16h（VTi65 轉(zhuǎn)頭）、 以45 000rpm離心48h（Ti50轉(zhuǎn)頭）、以60 000rpm離心24h（Ti65轉(zhuǎn)頭）或者以60 000rpm離心24h（Ti70.1轉(zhuǎn)頭）。普通光照下，在梯中心可見兩條DNA區(qū)帶， 上部區(qū)帶材料通常較少，由線狀的細(xì)菌（染色體）DNA和帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA組成：下部區(qū)帶則由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠RNA復(fù)合物，位于CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質(zhì)。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質(zhì)粒DNA而不至**負(fù)荷。如有較大量的質(zhì)粒存在，將擴(kuò)展為一條寬帶，并與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質(zhì)粒復(fù)制達(dá)到較高水平時才會出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現(xiàn)負(fù)荷，可收集整個DNA區(qū)高產(chǎn)水平時才會出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現(xiàn)**負(fù)荷，可收集整個DNA區(qū)帶，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）將體積調(diào)到15ml，在兩個離心管中再度離心，使DNA達(dá)到平衡。
⒍收集DNA帶。將21 號皮下注射針頭插入管的*以使空氣進(jìn)入，為盡量減少污染的機(jī)會，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶（雜色體DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后將一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體DNA區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內(nèi)，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端并將*2根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入*3根皮下注射針頭（18號），將下部的質(zhì)粒DNA區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。

二、不連續(xù)梯度的實(shí)驗(yàn)方法
該方法是將含不同濃度CsCl的溶液分層加到離心管中，這樣可以加速CsCl梯度的形成，使離心時間減少到6h。
⒈將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（ρ=1.47g/ml）。
⒉將8ml氯化銫溶液加到Beckman Quick-Seal 離心管（或與其相當(dāng)?shù)墓埽┲?，待用?
⒊如有必要，可酌情用TE(pH8.0)將質(zhì)粒DNA溶液的體積精確地調(diào)到3ml。
⒋在質(zhì)粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30℃以促進(jìn)鹽溶解， 小心地混勻溶液直至鹽溶解。
⒌稱量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達(dá)13.2g，用天平稱量時應(yīng)注意去除管的重量。
⒍加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水），快速混勻溶液直至染料均勻地分散，此時溶液瓣體積應(yīng)大約為7.5ml。小心：溴化乙錠是一咱強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。【溴化乙錠貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)（如用錫箔完全包裹的瓶子），于室溫保存?！?
⒎室溫下，用Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)法）以8000rpm離心5min，浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙2錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。
⒏將22.86cm的巴期德吸管放入裝有CsCl（步驟b制備）的離心管中， 吸頭應(yīng)接觸管底。用吸管小心地將步驟g所制備的清亮紅色溶液（來自浮渣之下）加入管內(nèi)，使樣本層位于CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情將步驟a中制備的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添滿離心管，封口。
⒐將封口的管，（與相應(yīng)的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭中），于20℃以60 000rpm度離心6h。
⒑回收閉環(huán)質(zhì)粒DNA區(qū)帶。
從經(jīng)過純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠，溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應(yīng)戴手套。

三、**溶劑抽提
用后溶液應(yīng)用下面的步驟進(jìn)行凈化處理。
⒈將DNA溶液放入玻璃或塑料管中，加等體積的水飽和1－丁醇或異戊醇。
⒉振蕩混合兩相。
⒊用臺式離心機(jī),室溫下以1500rpm，離心3min。
⒋用巴期德吸管將下層水相移至一干凈的玻璃或塑料管內(nèi)。
⒌反復(fù)抽提[步驟a－d]4－6次直到粉紅色從水相和**相中均消失。
⒍用以下任意一種方法從DNA溶液中除去CsCl：通過微量濃縮器（Amicon）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)透析，對TE(pH8.0)透析24-48h，并換液數(shù)次或者用3倍體積水進(jìn)行稀釋并于4℃用2倍體積乙醇（即終體積相當(dāng)于原未稀釋體積的6倍）沉淀15min，再以4℃，10 000rpm 離心15 min， 將沉淀的DNA溶于約1ml TE(pH8.0)中。如果將DNA的乙醇溶液置于-20℃，CsCl會沉淀。
⒎測定DNA較終溶液的OD260值，計(jì)算DNA的濃度， 將DNA分成小份貯存于-20℃。如果制備的DNA含有顯著量的溴化乙錠（依顏色判斷），可用酚、酚：氯仿各抽提1次，然后用乙醇沉淀DNA。

四、溴化乙錠溶液的凈化處理
溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性，取用含有這一染料的溶液時務(wù)必戴上手套，這些溶液經(jīng)使用應(yīng)按下面介紹的方法進(jìn)行凈化處理。
溴化乙錠濃溶液（即濃度>0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液）的凈化處理：
用沙門氏菌－微粒體測定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。
⒈加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。
⒉加入0.2體積新配制的5%次磷酸和0.12體積新配制的0.5mol/L 亞硝酸鈉，混勻。【檢測該溶液的pH值應(yīng)小于3.0。市售次磷酸一般為50%溶液，具有腐蝕性，應(yīng)小心操作，必須現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）應(yīng)用水溶解34.5g亞硝酸鈉并定容至終體積500ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。】
⒊于室溫溫育24h后，加入大大過量的1mol/L碳酸氫鈉。至此， 該溶液可予丟棄。

五、溴化乙錠希溶液的凈化處理
方法一
⒈每100ml溶液中加入2.9g Amberlite XAD－16，這是一種非離子型多聚吸附劑，可向Rohm和Haas 公司購置。
⒉于室溫下放置12h ，不時搖動。
⒊用 Whatman 1號 濾紙過濾溶液，丟棄慮液。
⒋用塑料袋封裝濾紙和Amberlite 樹脂，作為有害的廢物丟棄。
方法二
⒈每100ml溶液中加入100mg 粉狀活性炭。
⒉于室溫放置1h，不時搖動。
⒊用 Whatman 1號 濾紙過濾溶液，丟棄慮液。
⒋用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害的廢物丟棄。
以上就是小編對質(zhì)粒DNA純化的實(shí)驗(yàn)方法做出的分析，你還有什么需要補(bǔ)充的嗎？快來聯(lián)系我吧！

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