FFPE樣本核酸的提取

時(shí)間：2022-07-04作者：南京兔牙生物科技有限公司瀏覽：233

     01 樣本切片     

     石蠟樣本在提取前需要進(jìn)行切片處理，一般需要5-6個(gè)切片，一片鏡檢確定**細(xì)胞含量，其他進(jìn)行后續(xù)提取處理。切片的薄厚程度對(duì)后續(xù)觀察和提取會(huì)有一定影響。切片過厚不利于后續(xù)染色和組織學(xué)觀察，而且組織脫蠟和蛋白酶消化困難增加；切片過薄易造成DNA的機(jī)械損傷，同時(shí)切片總面積的增加，其表面黏附的PCR抑制因子將可能增多。

      為了避免FFPE樣品分子分析的問題，樣品染色應(yīng)盡可能避免。某些染料和試劑可能對(duì)核酸造成不利影響，特別是那些用于*組化染色的試劑。涉及高pH和重金屬離子的染色步驟應(yīng)當(dāng)避免。如果樣品染色是必需的，則可以選擇甲酚紫（cresyl violet），因?yàn)樗c核酸分析兼容。




      02 樣本脫蠟
      為消除石蠟對(duì)DNA提取和PCR擴(kuò)增的不良影響，必須在保證不增加外源性PCR抑制因子和盡量減少DNA額外損傷的前提下對(duì)組織進(jìn)行徹底的脫蠟。在此過程中，先溶解石蠟，然后去除，暴露樣品，用于后續(xù)裂解緩沖液和蛋白酶K（如果合適）的處理。多種溶劑適用于脫蠟，如二甲苯、庚烷和檸檬烯等。二甲苯脫蠟不僅容易造成核酸片段化和得率低，而且對(duì)人有毒害，切片越厚或存放時(shí)間越長(zhǎng)，脫蠟效果越差。作為溶劑法的替代，石蠟也可通過加熱與FFPE樣品分離：熔化后，石蠟冷卻，取決于其用量，石蠟粘在管壁上，或在樣品上形成一個(gè)固體層。
市面上主流試劑盒是采用無毒裂解液方法脫蠟，以及Covaris的超聲乳化脫蠟，納米級(jí)別的處理使得FFPE樣品徹底脫蠟和水化。
Covaris采用高頻率短波長(zhǎng)的醫(yī)用級(jí)別超聲波，儀器與樣本不進(jìn)行接觸，球型換能器產(chǎn)生超聲聚焦作用于樣本，能量利用率較高，方向和力度精準(zhǔn)可控，處理重復(fù)性好。




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